ChIP 实验

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Buffer 配置

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    • 下标：H<sub>2</sub> ：H2

需要单独预配的试剂：

  • 所有物品均为进口

  • 七个 250 ml 蓝盖瓶

  • 提前一天预约 4℃ 落地离心机和 4℃ 离心机

  • 1 ml 、200 ul、10ul 进口枪头各准备一盒

  • 2 L ddH2O 注意：保证为 18.2Ω 的超纯水，可去楼下 A 座棉花组接

  • 预配 50 ml 1M MgCl2 *：0.05 L * 1 M * 分子量 = g *MgCl2 溶于 50 ml ddH2O

  • 预配 50 ml 20% Triton X-100：10 ml Triton X-100 + 40 ml ddH2O （ 难溶，摇过夜，提前一天配好 ）

  • 预配 50 ml 2.5M LiCl：LiCL 的相对分子量为 42.3 g/M 。0.05 L * 2.5 M/L * 423.3 g/M = 5.29875 g ≈ 5.3 g 溶于 50ml ddH2O

  • 预配 50ml 0.2M NaHCO3：NaHCO<sub>3</sub> 的相对分子量为 84 g/M 。需要质量：0.05 L * 0.2 M/L * 84 g/M = 0.84 g ，溶于 50ml ddH2O

  • 50 ml 离心管 无水乙醇、50 ml 离心管 75% 乙醇

ChIP-BUFFER-1

Extraction buffer-1

Extraction buffer-1 500 ml 4℃
0.4 M Sucrose （公用） 68.46 g
1M Tris-HCl PH8.0（公用） 5 ml
1M MgCl2 （自己配） 175 ul
5mM β-ME （公用） 500 ul
Protease inhibitors （公用） 1 tablet（ EDTA-free ）
0.1 mM PMSF （公用） 500 ul
dd water （保证为 18.2Ω 的超纯水，可去楼下 A 座棉花组接） 加到 500 ml

注意： Protease inhibitors、PMSF、β-ME 这三种现加。这里需要自己预配 50 ml 1M MgCl2

Extraction buffer-2

Extraction buffer-2 200 ml 4℃
0.25 M Sucrose （公用） 17.12 g
1M Tris-HCl PH8.0（公用） 2 ml
1M MgCl2 （自己配） 2 ml
20% Triton X-100（自己配） 10 ml
5mM β-ME （公用） 70 ul
Protease inhibitors （公用） 半粒
0.1 mM PMSF （公用） 200 ul
dd water （保证为 18.2Ω 的超纯水，可去楼下 A 座棉花组接） 加到 200 ml

注意： Protease inhibitors、PMSF、β-ME 这三种现加。20% Triton X-100 提前一天配好。

Extraction buffer-3 ( 粘稠难溶 )

Extraction buffer-2 40 ml 4℃
1.7 M Sucrose （公用） 23.28 g
1M Tris-HCl PH8.0（公用） 400 ul
1M MgCl2 （自己配） 80 ul
20% Triton X-100（自己配） 300 ul
5mM β-ME （公用） 14 ul
Protease inhibitors （公用） 半粒
0.1 mM PMSF （公用） 40 ul
dd water （保证为 18.2Ω 的超纯水，可去楼下 A 座棉花组接） 加到 40 ml

ChIP BUFFER-2

Nuclear lysis buffer

Nuclear lysis buffer 5 ml 4℃
1M Tris-HCl PH8.0（公用） 250 ul
0.5 M EDTA（公用） 100 ul
10% NaCl （公用） 100 ul（ 可不加 ）
10% SDS（公用） 500 ul（ 最后一步加 ）
0.1 mM PMSF （公用） 1 ul
Protease inhibitors （公用） 50ul （ 一颗溶于 1 ml ddH2O）
dd water （保证为 18.2Ω 的超纯水，可去楼下 A 座棉花组接） 加到 5 ml （ 加水 4.1 ml ）

注意现配现用，最后一步再加 SDS

Low salt wash buffer

Low salt wash buffer 100 ml 4℃
5M NaCl（公用） 3 ml
10% SDS（公用） 1 ml（ 最后一步加 ）
20% Triton X-100 （自己配） 5 ml
0.5M EDTA（公用） 400 ul
1M Tris-HCl PH8.0（公用） 2 ml
dd water （保证为 18.2Ω 的超纯水，可去楼下 A 座棉花组接） 加水到 100 ml
#### High salt wash buffer
High salt wash buffer 100 ml 4℃
5M NaCl（公用） 10 ml
10% SDS（公用） 1 ml（ 最后一步加 ）
20% Triton X-100 （自己配） 5 ml
0.5M EDTA（公用） 400 ul
1M Tris-HCl PH8.0（公用） 2 ml
dd water （保证为 18.2Ω 的超纯水，可去楼下 A 座棉花组接） 加水到 100 ml

LiCl wash buffer

LiCl wash buffer 100 ml 4℃
2.5M LiCl（自己配，固体在冰箱二层，白瓶子） 10 ml
0.5% NP-40（公用） 1 ml（ 最后一步加 ）
0.25% sodium deoxycholate （自己配，冰箱二层，白瓶子） 1g
0.5M EDTA（公用） 200 ul
1M Tris-HCl PH8.0（公用） 1 ml
dd water （保证为 18.2Ω 的超纯水，可去楼下 A 座棉花组接） 加水到 100 ml

注意这里需要自己配置 2.5M LiCl：LiCL 的相对分子量为 42.3 g/M 。

需要质量：0.05 L * 2.5 M/L * 423.3 g/M = 5.29875 g ≈ 5.3 g

ChIP BUFFER-3

TE buffer

1x TE buffer 50 ml 4℃
1M Tris-HCl PH8.0（公用） 1 ml
0.5M EDTA（公用） 100 ul
dd water （保证为 18.2Ω 的超纯水，可去楼下 A 座棉花组接） 加水到 50 ml

ChIP Chromatin Elution buffer

ChIP Chromatin Elution buffer 10 ml RT
10% SDS（公用） 1 ml
0.2M NaHCO3（自己配置，固体在 sigma 进口橱柜） 5 ml
dd water （保证为 18.2Ω 的超纯水，可去楼下 A 座棉花组接） 4 ml

注意这里需要自己配置 0.2M NaHCO3：NaHCO<sub>3</sub> 的相对分子量为 84 g/M 。

需要质量：0.05 L * 0.2 M/L * 84 g/M = 0.84 g

ChIP antibody dilution and magnetic beads （Protein A）washing buffer

dilution & wash buffer 100 ml 4 ℃
5M NaCl（公用） 3.34 ml
20% Triton X-100 （自己配） 5.5 ml
0.5M EDTA（公用） 240 ul
1M Tris-HCl PH8.0（公用） 1.67 ml
dd water （保证为 18.2Ω 的超纯水，可去楼下 A 座棉花组接） 加水到 100 ml

实验操作

1 甲醛交联

    1. 称取 2 g 组织，加入30 ml 1% 的甲醛（ EBI 稀释 ）进行交联 30 min （ 感觉这个时间有点长 ）。
    2. 加入 2 ml 2M 甘氨酸，混匀，重新放入真空仪（ 注意：置于冰盒中，用海绵塞住样品上方 ），抽真空 5 min 终止交联。
    3. 用 dd 水清洗三遍，取出，用纸吸干水分。至于液氮中，-70℃ 保存。

2 染色质抽提

  • 提前一天预约 4℃ 落地离心机和 4℃ 离心机
  • 准备一个大的冰盒。
  • 准备漏斗（ 一个样品一个 ）、50ml 尖底离心管（第一次过滤用）、50ml 圆底离心管（第二次过滤用）
  • 检查膜布是否还有
  • 提前 1h 4 ℃ 冷冻落地离心机
    1. 50 ml 进口离心管中加入 30 ml EBI，冰上预冷。
    2. 取出交联好的样品，研磨成粉末。在 2.1 中预冷的 30 ml EBI 中加入粉末，迅速摇匀，埋入冰盒中。冰盒放置在摇床上摇 30 min （ 摇床速度高速 ）
    3. 将单层的膜布至于干净漏斗上，将样品进行过滤至新的 50ml 尖底离心管中，再用双层膜布将过滤后的样品过滤到 50ml 圆底离心管中。
    4. 离心之前，用 EBI，平衡所有离心管，保证重量一致。4℃ 离心 4000 rpm 20 min。
      • 4℃ 落地离心机使用：
        • 4000 rpm
        • JA17 转子
        • 20min
        • 参数：ACCEL：MAX，DECEL：MAX
    5. 离心结束后，小心去除离心管，倒去上清（ 注意：倒的方向背离沉淀方向 ）。加入 1ml EB2，对准离心管壁沉淀反复轻柔吹洗混匀进行重悬，将重悬液移至 1.5 ml 进口离心管中（注意：冰上操作，尽量不要产生气泡）。
    6. 4℃ 离心 12000g 5min，倒掉上清，加 EB2 反复清洗，直至染色质沉淀泛白（冰上，重复 EB2 重悬，离心大概 5~ 6 次左右）。（此步骤大约 40 min）
    7. 最后一次离心完后，用枪吸干上清，加入 500 ul EB3（ 样品少时候可只加 300 ul **），在冰上**重悬染色质沉淀。
    8. 取一新的 1.5 ml 离心管，加入 500 ul EB3（ *样品少时候可只加 300 ul，不过前后要对应 *），小心将2.6中的重悬液加入到其中。
    9. 4℃ 离心 16000g 1h
    10. 离心完后，吸干上清，加入 400ul 2x Nuclear lysis buffer （ 样品少时候可只加 300 ul，不过前后要对应 ** ）重悬裂解** 15~20 min，取 15 ul 作为超声波处理前的染色质对照，用于检测染色质的完整性（ 可不做 ），剩余样品进行超声波打断，都至于 -80 ℃ 保存
      1. 这里需要看加完 400 ul 后，样品不浓稠即可，不然影响后续超声波破碎。

3 染色质超声波化

  • 准备：50 ml 离心管 无水乙醇、50 ml 离心管 75% 乙醇

    1. 将剩余样品取出，进行超声波打断。
    • 超声波操作：A506 ，打一盒冰，加冰至超声波仪器黑线附近，冰不融化即可将样品加入进行超声波打断。调整每次五分钟，其他按键不需要变动。（第一次 5 ~ 6 次左右，即 30 min，每一次后需要加冰，使温度保持低温，然后吸取 15ul 检测打断效果。不过一般是需要打断 2h 左右。根据后面纯化的 DNA 跑胶检测再进行决定超声波多久。）

    1. 取 15 ul 超声波后的染色质与之前取出的未进行超声波的 15ul 染色质分别加入：465 ml ddH2O ** 、20 ul 5M NaCl。65℃ 解交联（ **仪器在照胶室 ）6h 以上。剩下的染色质 -80℃ 保存。

      1. 仪器操作：RPM 80 Temp 65℃
      2. 这里可以加一步：解交联后再加入 10ul RNAaes(1:50 加) 42℃ 进行孵育 1h，去除 RNA。

    2. 取出解交联染色质，加入等体积的 24:1 氯仿：异戊酸 500 ul，手动混匀 5 min，然后 12000 rpm 5min。小心吸取上清 400 ul 左右至新的离心管中，加入 80 ul 3M NaAC、720 ul 预冷无水乙醇、2 ul 肝糖原（ -20℃ 的 二抗盒子中，白色管子 ），-70℃ 沉淀 1 h 或者 -20℃ 过夜。

    3. 4℃ 12000 rpm 20 min，弃上清（ 倒扣纸面倒干净液体 ），加入 1 ml 75% 乙醇。4℃ 12000 rpm *5 min , 弃上清，再稍离心，用枪小心吸干残液。离心管至于超净台吹干 15 min （ *看不到液体即可 ），加入 20 ul ddH2O ，37℃ 烘箱溶解 15 min。2% 琼脂糖凝胶进行检测。

      1. 进行离心 20min 过程可以制备一条 2% 的胶。
      2. 若片段大小不是集中在 200bp 附近，继续进行超声波打断，然后纯化检测片段大小。

4 染色质前处理和免疫共沉淀

  • 需要准备 Protein A Beads、 磁力架、静音混合器、ChIP dilution & wash buffer

  • Protein A Beads 洗涤（ 一般晚上进行 ）（ 涉及 Beads 的都是磁力架操作 ）

    • 40 ul Beads（ 样品少时候加入 20ul 即可 ） + *1 ml ChIP dilution & wash buffer * 洗涤三次

      1. 第一次上下混匀 Beads 与 buffer，然后在磁力架上摇晃吸附 Beads **直至澄清，不离开磁力架**倒掉清液。

      2. 第二次加入 1 ml Buffer, 取下架子，混匀，放置在 4℃ 冰箱中的静音混合器上 10 min 洗涤。然后在磁力架上摇晃吸附 Beads **直至澄清，不离开磁力架**倒掉清液。

      3. 第三次加入 1ml Buffer ，混匀，放置在磁力架上，上下颠倒数次至澄清，倒掉清液，用枪吸干残液，去掉气泡。

      4. 加入 40 ul Buffer ，沿 Beads 上面缓慢加入（ 由于加的 Buffer 量上，所以对着 Beads, 后续操作均不对着 Beads 加 ），尽量不要产生气泡，放置冰上。

      5. 进行 4 后，将超声波后染色质进行 4℃ 12000rpm 5min，吸上清，取 20 ul 作为 Input ，剩下的加入到洗涤后的 Beads 中，混匀。然后放置在 4℃ 冰箱中静音混合器 2h。然后 4℃ 12000rpm 5min，放置在磁力架上，吸上清至一个新的 1.5 ml 离心管中。

      6. 在步骤 5 中静音混合器上 2h 的过程中，可以将吸出的 Input 再解交联纯化，测每个样品的 DNA 浓度，进行定量。

        DNA 浓度 后面定量加入的染色质
        100 ng/ul（ 最高浓度 ） 100 ul
        50 ng/ul 200 ul （ 相对最高浓度加的量 ）

  • 抗体孵育（ 一般晚上 十点 ~ 十一点左右做 ）（ 涉及 Beads 的都是磁力架操作 ）

    • 50 ul Beads + *1 ml ChIP dilution & wash buffer * 洗涤三次
      1. 第一次上下混匀 Beads 与 buffer，然后在磁力架上摇晃吸附 Beads **直至澄清，不离开磁力架**倒掉清液。
      2. 第二次加入 1 ml Buffer（ 对着 Beads 对面壁加 ）, 取下架子，混匀，放置在 4℃ 冰箱中的静音混合器上 10 min 洗涤。然后在磁力架上摇晃吸附 Beads **直至澄清，不离开磁力架**倒掉清液。
      3. 第三次加入 1 ml Buffer（ 对着 Beads 对面壁加 ）, 取下架子，混匀，放置在 4℃ 冰箱中的静音混合器上 10 min 洗涤。然后在磁力架上摇晃吸附 Beads **直至澄清，不离开磁力架**倒掉清液，吸掉残液、去掉气泡。
      4. 加 560 ul Buffer + 5 ul 抗体，仍在磁力架上先混匀抗体，然后再离开磁力架将 Beads 混匀，4℃ 冰箱中的静音混合器 过夜（ 6 h ）。

  • 抗体与 Beads 洗涤（ 涉及 Beads 的都是磁力架操作 ）

      1. 孵育好的抗体同之前一样，用 1 ml ChIP dilution & wash buffer 洗涤 四次 （ 这一步要保证洗涤干净），一快三慢。
      2. 倒掉上清液，加入 900ul ChIP dilution & wash buffer + 相对定量的体积的染色质（ 100ul ） ，摇匀，4℃ 冰箱中的静音混合器 6 h。

5洗涤

    1. 孵育结束后，将离心管至于磁力架上，直接拿磁力架倒掉管中上清，用枪吸干残液、去掉气泡。

    2. 按顺序加入下列 washing Buffer 各 1 ml，分别洗涤两次，一快一慢。

      1. 快：颠倒离心管，将 Beads 完全重悬后即可放在磁力架上，弃上清
      2. 慢：颠倒离心管，将 Beads 完全重悬后放在 4℃ 冰箱中的静音混合器上 10 min，然后再将其放置在磁力架上上下颠倒几次，弃上清，用枪吸干残液、去掉气泡
      low salt wash buffer 一次快洗，一次慢洗 10 min
      High salt wash buffer 一次快洗，一次慢洗 10 min
      LiCl salt 一次快洗，一次慢洗 10 min
      TE buffer 一次快洗，一次慢洗 10 min

    3. 最后一次 TE buffer 后，磁力架上完全吸干上清，去掉气泡。对着 Beads 加 250 ul Elution buffer，重悬混匀，65℃ 15 min，瞬离将盖子上液体离心下去，磁力架上吸上清于另一干净的 1.5 ml 管子中。

    4. 再对着 Beads 加 250 ul Elution buffer，重悬混匀，65℃ 15 min，瞬离将盖子上液体离心下去，磁力架上吸上清于上一步 3 ** 的 **1.5 ml 管子中。

    5. 在上面两次的上清混合液中加入 20 ul 5M NaCl，65℃ 解交联过夜（ 6h 以上）

6 纯化

  • 纯化
    1. 在解交联产物中加入以下试剂，45℃ 1 h
      1. 10 ul 0.5M EDTA
      2. 20 ul 1M Tris-HCl PH 7.5
      3. 2 ul Protein K
      4. 5 ul RNAase
    2. 纯化 DNA ，步骤同前 3.3 — 3.4。
    3. 取出解交联染色质，加入等体积的 24:1 氯仿：异戊酸 500 ul，手动混匀 5 min，然后 12000 rpm 20min。小心吸取上清 400 ul （ 宁愿少吸点也不要吸到杂质 ）左右至新的离心管中，加入 80 ul 3M NaAC、720 ul 预冷无水乙醇（ 一定要保证干净，尽量在这一步重新配置 ）、2 ul 肝糖原（ -20℃ 的 二抗盒子中，白色管子 ），-80℃ 沉淀 6 h （ 推荐 -80 ℃，尽量多沉淀 ）
    4. 4℃ 12000 rpm 20 min，弃上清（ 倒扣纸面倒干净液体 ），加入 1 ml 75% 乙醇 （ 一定要保证干净，尽量在这一步重新配置）。4℃ 12000 rpm 20 min , 弃上清，再加入 1 ml 干净的无水乙醇 4℃ 12000 rpm 20 min *，弃上清，离心管至于超净台吹干 15 min （ *白色沉淀变透明，即看不到即可 ），加入 15 ul ddH2O（ 一定要干净 ） ，弹匀，使尽量覆盖分散在管壁。